Cinética e Regulação Enzimática
Ano Letivo: 2015/16
Departamento: Biologia Vegetal
Carga horária:
Área Científica: Biologia;
Objetivos da Unidade Curricular
Pretende-se que os estudantes adquiram conhecimentos avançados sobre os mecanismos de acção dos catalisadores biológicos e do transporte membranar e sua regulação, no contexto do funcionamento dos organismos vivos. Serão estudados as bases teóricas para a integração dos mecanismos de regulação e controlo de vias metabólicas, em sistemas biológicos de maior complexidade, desde as células aos organismos.
A aprovação na disciplina corresponderá à compreensão dos conceitos apresentados e à capacidade de utilização, manipulação e exploração de resultados experimentais.
Pré-requisitos
Sem pré-requisitosConteúdos
Princípios gerais de catálise. Estrutura da molécula enzimática. Noção de “centro activo”. Modelos de Fisher, de Koshland e de Pauling
Cinética Enzimática. Definição de velocidade máxima (Vmax). Conceito de KM:modelos de Michaelis-Menten, van Slick-Cullen e Briggs-Haldane. Determinação de parâmetros cinéticos. Inibição: mecanismos de inibição da actividade enzimática e consequências cinéticas. Representações gráficas.
Regulação e controlo da actividade enzimática. Cinética sigmoidal. Alosteria. Modelos explicativos. Regulação a nível das vias e sistemas metabólicos. Determinação experimental da “reacção limitante” e consequências teóricas. Teoria da análise do controlo metabólicos (MCA). Definições. Desenvolvimentos subsequentes.
Aplicações.
Laboratoriais: demostrações laboratoriais dos conceitos adquiridos
Teórico-práticas: utilização e exploração dos conceitos adquiridos
Descrição detalhada dos conteúdos programáticos
Componente Teórica
Cinética Enzimática. Evolução de conceitos em enzimologia. Natureza e função dos enzimas. Características fundamentais da acção enzimática: especificidade na catálise e aceleração da taxa de reacção
Estrutura da molécula enzimática. Cofactores e grupos prostéticos; coenzimas. Configuração e mobilidade conformacional das proteínas enzimáticas
Princípios gerais de catálise, Lei de acção das massas de Guldberg e Waage e acção enzimática. Teoria do estado de transição. Postulado de Hammond
Catálise enzimática. Noção de “centro activo”. Teorias explicativas da acção enzimática. Modelos de Fisher, de Koshland e de Pauling. Mecanismos moleculares de reacção no centro activo de um enzima
Cinética enzimática. Efeito de factores físicos e químicos sobre a cinética enzimática. Cinética de Michaelis-Menten. Definição de velocidade máxima. Evolução do conceito de KM: da cinética de equilíbrio (Michaelis e Menten) à cinética do estado estacionário (Briggs e Haldane). Constante catalítica kcat. Constante de especificidade (kcat/Km). Determinações gráficas de parâmetros cinéticos. Derivações matemáticas da equação de Michelis-Menten. Linearizações e representações gráficas. Cinética de reacções enzimáticas com vários substratos. Mecanismos sequencial, ordenado, ping-pong e de Theorell-Chance. Cinética de reacções reversíveis. Equação de Haldane
Inibição. Mecanismos de inibição da actividade enzimática. Definições. Consequências cinéticas da inibição. Constantes de inibição. Equação de Dixon. Representações gráficas.
Regulação e controlo da actividade enzimática. Regulação ao nível da molécula enzimática. Mecanismos de regulação. Cinética sigmoidal. Alosteria. Modelo concertado de Monod-Wyman-Changeux. Modelo sequencial de Koshland-Némethy-Filmer. Modelo generalizado. Análise dos modelos propostos: utilidade e críticas.
Regulação a nível das vias e sistemas metabólicos. Reacções afastados do equilíbrio numa via metabólica em estado estacionário. Medição do fluxo metabólico. Teorema do cross-over. Actividades máximas de enzimas na via. Noção de capacidade enzimática. Alteração experimental dos intermediários metabólicos. Alteração na produção de proteína enzimática. RNA de interferência. Análise do controlo das vias metabólicas. Coeficientes de controlo do fluxo: definição e significado. Teorema da soma (dos coeficientes de controlo de fluxo). Coeficientes de controlo pelo substrato: definição e significado. Elasticidade: definição e exemplos. Coeficientes de resposta
Aplicações. Análise enzimática em medicina e em ciência forense. Alterações congénitas do metabolism. Química clínica. Bioetecnologia. Produção industrial de enzimas. Utilização de enzimas em processos industriais. Enzimas imobilizados. Indústria alimentar
Componente Teórica-Prática
pH e tampões
Introdução a métodos de doseamento de proteínas solúveis
Princípios gerais de extracção de enzimas. Velocidade de reacção: unidades e métodos de determinação
Equação de M-M. Métodos de linearização da equação de M-M e determinação dos parâmetros cinéticos kme Vmax
Inibição reversível e inibição irreversível. Determinação do tipo de inibição e da constante de inibição ki
Efeito da temperatura na actividade enzimática. Equação de Arrhenius. Cálculo da energia de activação
Componente Prática
pH. Preparação de soluções tampão.
Doseamento de proteínas solúveis pelo método de Bradford.
Extracção e ensaio da catalase por espectrofotometria.
Efeito da concentração de enzima na velocidade de reacção.
Ensaio da catalase a diferentes concentrações de substrato.
Inibição da Fosfoenolpiruvato carboxilase pelo L-malato.
Bibliografia
Recomendada
P. Boyer (1970), The Enzymes (student ed.)
C. Branden e J. Tooze (1991), Introduction to Protein Structure
A. Cornish-Bowden (1995), Fundamentals of Enzyme Kinetics
A. Cornish-Bowden e C. W. Wharton (1988), Enzyme Kinetics
D. Fell (1997), Understanding the Control of Metabolism
A. Fersht (1999), Structure and Mechanism in Protein Science, Freeman
J. H. Ottaway (1988), Regulation of Enzyme Activity
T. Palmer & P. Bonner (2007), Enzymes: Biochemistry, Biotechnology, Clinical Chemistry, 2th ed.,
M. Perutz (1990), Mechanisms of Cooperativity and Allosteric Regulation in Proteins
N. C. Price e L. Stevens (2000), Fundamentals of Enzymology
V. L. Schramm (2011), Ann. Rev.Biochem. 80:703-732, Enzymatic Transition States, Transition-State Analogs, Dynamics, Thermodynamics, and Lifetimes
R. Schulz (1994), Enzyme Kinetics, from Diastase to Multi-Enzyme Systems
Outros elementos de estudo
Figuras nas aulas teóricas e teórico-práticas
Protocolos nas aulas laboratoriais
Quizes para auto-análise na aulas teóricas
"Papers" escolhidos, em revistas internacionais, publicados nos últimos 5 anos
Métodos de Ensino
Aulas magistrais na componente teórica (AT), com estímulo activo ao diálogo e à interrogação
Tutoriais facultativas (AT, TP, TL)
Aulas presenciais (TP) com número menor de estudantes, para discussão e esclarecimento de matérias das aula teóricas e laboratoriais
Aula laboratoriais (TL) idelamente com um máximo de 15 alunos, com protocolos experimentais, em que são ensaiados os conceitos e técnicasintroduzidos nas AT e TP
Métodos de Avaliação
Avaliação contínua e relatórios nas aulas laboratoriais
Prova escrita final
Prova oral (se necessária)
Língua de ensino
Português
Bibliografia basicamente em inglês